pcr的荧光探针有哪些

一、TaqMan探针

1.结构

TaqMan探针是一种双标记、自淬灭的水解探针，其5端标有荧光基团(如FAMan探针)、HEX等。)，3端标有淬灭基团(如TAMRA)、BHQ等)。

其中，淬灭剂的发展经历了一些选择的演变。TAMRA是最早的淬灭剂，与FAM荧光基团一起使用，实现了实时荧光检测的目的。然而，TAMRA作为一种具有荧光的淬灭剂，具有较高的背景信号和较窄的波长选择范围，其应用非常有限。

后来开发了一种暗淬灭剂(Dark Quenchers)，比如DABCYL。这种淬灭剂在可见光谱中没有发射光，不同于荧光淬灭剂(如TAMRA)，其从荧光基团吸收的激发能以热能而不是光能的形式消耗，从而减少了背景信号。但DABCYL只能在很小范围内吸收波长，这限制了它在多个QPCR中的应用。

黑洞淬灭剂为了满足多个qpcr应用，(Black Hole Quencher, BHQ)便便应运而生。BHQ可以在较长的波长下工作，在可见光谱中具有高效的淬灭能力，与之匹配的荧光基团波长选择范围较大。现有BHQ染料的淬灭波长范围可考虑430 nm~730 nm，多个QPCR检测可以通过不同的BHQ和不同的荧光基团来实现。为了避免专利或提高淬灭效果，一些公司还开发了其他类似的淬灭剂，如IDT(Integrated DNA Technologies)公司淬灭基团：IBFQ(Iowa Black®️ FQ)和IBRQ(Iowa BlackRQ)。

2.原理

基于荧光共振能量转移的实时QPCR(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)试验原理实现的，即当探针处于完整状态，且荧光基团因折叠卷曲而相对接近淬灭基团时，淬灭基团可吸收荧光基团发射的荧光，导向仪器无法检测到信号；当探针与目标序列相结合，并在扩展过程中被Taq酶水解时，其荧光基团释放到反应系统中，与淬灭基团分离，仪器可以检测到激发光下产生的信号。

二、MGB探针

1.结构

除荧光基团和淬灭基团外，MGB探针在两端分别标有3‘5’探针′小沟结合物也连接到末端(Minor groove binding, MGB)，其中，标记的淬灭基团为不发光淬灭基团(non-fluorescent quencher, NFQ)，MGB多为小分子三肽，可与双链DNA小沟非共价结合，稳定DNA结构。

MGB探针包括MGB-TaqMan探针。MGB-三种类型：Pleiades探针和MGB-Eclipse探针。TaqMan-MGB探针是将MGB连接到TaqMan探针的3端，作为一种水解探针，在扩展过程中被Taq酶水解后释放荧光基团产生信号。Pleiades-在MGB探针的5端标记荧光基团，并连接到MGB、3端标记淬灭基团；Eclipse-MGB探针在5端标记淬灭基团，连接MGB、荧光基团标记在3端。Pleiades-MGB探针和Eclipse-MGB探针都是杂交探针，连接到5端的MGB可以防止Taq酶水解，因此荧光基团和淬灭基团在与靶序列杂交后产生荧光信号。

2.优势

1. 将MGB修饰的探针与靶序列相结合的TM值可提高15~30℃，使设计的探针序列更短；

2. MGB探针采用无荧光淬灭基团(NFQ)，可大大消除传统淬灭基团产生的背景荧光，提高信噪比；

3. MGB与DNA双链小沟相结合，可稳定AT-rich序列，降低TM值对实验的影响；

4. MGB探针可用于检测短片段的保守序列或SNP。突变位点一般设计在探针中间的三分之一，可用于区分单碱基突变；

5. 在使用Pleiades-MGB探针或Eclipse-MGB探针进行检测后，扩展后的产品也可以进行熔化曲线分析。

三、双淬灭探针

1.结构

传统单淬灭探针5的端为荧光基团，3的端为淬灭基团，双淬灭探针在探针内增加了第二个淬灭基团，使淬灭效果更加完整。

以IDT双淬灭探针为例，探针第9或10位碱基连接上的第二个淬灭基团：ZEN™️淬灭剂或TAO™️淬灭剂。

ZEN双淬灭探针含有5个′端荧光基团，一个3′端Iowa Black™ FQ(IBFQ)淬灭基团，以及专有的内置ZEN淬灭基团，其最常用的5′FAMM包括端荧光基包括FAM、TET、Yakima Yellow、SUN或HEX。

TAO双淬灭探针5′端Cy 5荧光基团，一个3′端Iowa Black RQ (IBRQ) 淬灭基团，以及专有的内置TAO淬灭基团。

2.优势

1. 双淬灭探针有双重保证。除了探针3端的普通淬灭基团外，还增加了第二个淬灭基团，可以降低底部信号，提高信噪比；

2. 传统探针长度一般为20~30bp，双淬灭探针可设计较长，达到40个碱基；

3. 在多个qpcr检测中，双淬灭探针可以减少多通道检测中荧光信号的串扰；

4. 双淬灭探针还能增强双链结构的稳定性，防止核酸外切酶的酶切割，无细胞毒性，可应用于anti-miRNA序列和miRNA、原位杂交，如MRNA。

四、锁核酸探针

1.结构

锁核酸(Locked nucleic acid, LNA)它是一种高亲和力RNA类似物，通过亚甲基(下图蓝色部分)连接，限制了呋喃核糖环的灵活性，将其“锁定”为刚性双环结构，但不影响其遵循Watson-Crick碱基配对原则，它还可以与互补的DNA或RNA杂交形成双链体。

2.优势

1. LNA合成与标准寡核苷酸合成相容，可直接将单个或多个合成 LNA 选择性地将核苷酸位点与探针序列混合，调整探针识别能力和TM值；

2. 添加LNA核苷酸可以提高探针与靶序列相结合的热稳定性。每添加LNA核苷酸，探针TM值可增加2~8℃，探针长度可设计较短，依赖序列GC含量较低；

3. 同一序列，LNA修改的探针TM值较高；相同的TM值，LNA修改的探针序列可以设计得更短，使LNA探针非常适合检测长度较短或相似度较高的目标序列；

4. LNA探针具有较高的识别能力和亲和力，可以显著提高完全匹配和错配碱基之间的TM值差异，更有效地区分SNP；

5. LNA具有高核酸酶抗性，在体内外相对稳定，可应用于反义技术。

五、肽核酸探针

1.结构

肽核酸(Peptide Nucleic Acid, PNA)它是一种合成的DNA类似物，结构上保留了DNA的碱基和脱氧核糖，但原来的核糖磷酸骨架被类似肽键的酰胺键骨架(图中红圈标记)所取代。因此，PNA仍然遵循碱基互补配对的原则，而骨架从原来的负电性转变为近中性，削弱了双链核酸之间的静电排斥，大大提高了LNA与DNA或RNA的结合稳定性和特异性。而且PNA的酰胺键骨架不易被核酸酶和蛋白酶水解，使其在体内外极其稳定。

2.优势

1. 与传统的DNA-DNA序列相比，PNA探针具有较高的TM值，每增加一个PNA碱基，其TM值相应增加至少1℃；

2. PNA的电中性骨架可以减少与DNA和RNA链的静电排斥，使PNA与靶序列具有更高的亲和力；

3. PNA具有高特异性和高灵敏度，碱基对的错配可以使 Tm 显著降低值可用于区分单碱基突变；

4. PNA具有良好的稳定性，可在高温或高pH条件下稳定存在；由于没有核酸酶和蛋白酶的识别点，酶降解的抗性也更强；

5. PNA与靶序列的杂交结合强度不依赖于盐离子浓度，杂交速度更快，可提高100-5000倍。

综上所述，探针的改进一方面是为了提高检测信噪比，使结果更加灵敏和特殊；另一方面是为了提高探针设计的灵活性，使其应用范围更广。标准核苷酸的人工改造给其带来了更多的可能性，不仅可以大大扩大寡核苷酸探针的应用范围，还可以为合成寡核苷酸开辟新的应用领域，使其应用方向更加可控。