分子POCT技术介绍

2023-02-08 14:32
POCT是即时检测(Point of Care Testing)的简称,指通过现场采样、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到结果的一种检测方式。WHO在2006年要求建立的POCT方法应符合ASSURED标准,即可承担(Affordable)、灵敏度高(Sensitive)、特异性好(Specific)、操作友好(User-friendly)、快速并可重复(Rapid and Robust)、无需仪器(Equipment-free)和易获取(Delivered to the end user)。随着技术更新和需求变化,2019年补充了实时通信(Real-time connectivity)和样本采集便捷(Ease of specimen collection),即REASSURED标准。

与传统方法相比,POCT以其仪器小型便捷、样本周转时间短、操作简单的特有优势,深受用户的欢迎并逐渐广泛使用,在包括重大疫情监控、慢病监测、传染病检测、现场执法检测、医学救援、海关检验检疫、食品安全、毒品检验等卫生领域,承担了现场检验的重任。

一、POCT介绍

常用的POCT技术早期主要以定性检测为主,包括干化学、胶体金、免疫层析等。随着研究的进展以及对检测需求的逐步提升,以免疫荧光、化学发光、微流控等技术为核心的POCT产品快速发展并率先应用于临床,实现了快速的定量检测并提高了准确性。目前,POCT 不仅用于血糖检测和早期妊娠的检测,还广泛应用于心血管疾病、急慢性肾病、感染性疾病、凝血检测、药物浓度监测等方面。使用场所也从医疗机构中门急诊、ICU逐步向家庭、海关、基层机构和诊所等延伸领域,并扩展到食品卫生、环境检测、禁毒、法医等领域。

二、分子POCT技术

随着分子诊断技术的发展,其快速、精准、高效的特点,被广泛应用于病原体检测、肿瘤、遗传病等领域,特别是对难以培养、生长缓慢、罕见或新发再现病原体检测方面均表现出明显优势。但常规核酸检测方法对人员专业素质要求高、设备复杂、测试周期较长,对儿科、重症感染的病原学确诊往往滞后,有效缩短等待时间和诊疗时间已成为当前的迫切需求。

分子POCT平台结合了即时检测和分子生物学技术的特点,在实现“提取-扩增-检测”整合一体化的同时,兼具便携、操作简易、快速、密闭性好的特点,同时保持高特异性和敏感性。分子POCT省去了基因扩增实验室分区的要求和大型仪器设备检测的步骤,也简化了数据处理等繁琐过程,可直接快速地得到可靠的结果用于指导患者治疗,虽仍然不能脱离基因扩增实验室,但随着新技术/新方法的出现,这部分限制被逐渐解决,为院内感染诊治和居家自测的疾病管理,提供了重要技术支撑和保障。

目前开发的分子POCT诊断产品多应用于病毒检测(新冠、流感病毒A/B、合胞病毒、HIV、HBV、HCV等)、细菌耐药检测(结核分支杆菌及利福平耐药、多重耐药菌CRE)、STD(沙眼衣原体、淋球菌、GBS等)、症候群检测(腹泻症候群、血流感染症候群、中枢神经感染症候群等)以及肿瘤基因检测。(表1)中罗列了市场上常见的分子POCT企业,方法学多采用PCR和恒温扩增的方法,在样本采集、产品形态和结果报告都有各自的特点,后续也会有更多的产品落地。


三、基于CRISPR技术的分子POCT介绍

以基于CRISPR为代表的新型诊断技术逐步开发成功。不同于前面介绍的PCR和恒温技术,该技术依赖Cas蛋白/sgRNA复合物精准识别和剪切目标基因,同时会非特异的、持续的切割带有荧光基团和猝灭基团的报告分子(即反式切割),并释放大量荧光信号,达到检测的目的。持续的反式剪切带来的高灵敏度,精准识别的高特异性,大幅降低了恒温扩增的假阳性风险,且不依赖于复杂或大型的设备,给诊断发展提供了新的方式。自从2016年发现反式切割活性以来,6年间已有多个蛋白Cas9、Cas 12a、Cas 12b、Cas 13a和Cas 14等多种效应蛋白被证明均具有该活性(图3),基于上述特点,CRISPR/Cas系统在分子POCT中展现出极大的应用前景。

四、总结


基于QPCR、恒温扩增和CRISPR等技术的POCT平台,通过荧光、比色法、电化学等多种检测模式,为现场即时诊断提供了新技术、新方法,未来仍将在准确性、成本控制、检测时间、指标数量、检测通量、产品易用性上继续优化。同时,在不断完善质量控制的前提下,持续带动检测需求,拓宽应用场景,在提升国家医疗质量安全、公共卫生紧急应对以及建立分级诊疗、远程医疗和移动检测模式等方面提供有力支持。


参考文献:

【1】 REASSURED diagnostics to inform disease control strategies, strengthen health systems and improve patient outcomes

【2】Infectious Disease and the Application of Point of Care Testing (POCT) in India

【3】现场快速检测(POCT)基层医疗卫生机构应用专家共识

【4】行业报告:2022年中国POCT行业研究报告

【5】分子即时检测( POCT) 技术及其在新发传染病中的应用

【6】CRISPR Approaches for the Diagnosis of Human Diseases

【7】迅识生物公众号:CRISPR介绍--CRISPR发展史




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